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                      蛋白制備

                      蛋白制備

                      簡要描述:
                      蛋白制備
                      提供重組蛋白制備生產服務
                      1.His、GST、MBP等標簽多種表達方式同時進行,確保獲得目的蛋白
                      2.保證蛋白為普通緩沖可溶
                      3.純化的蛋白經過ELISA,Western-blot,或者其它生物活性驗證
                      4.可提供詳細表達純化條件,實驗數據以及菌株

                      更新時間:2024-03-27

                      訪問量:1505

                      廠商性質:生產廠家

                      生產地址:上海

                      蛋白制備

                      1. 獲得目的基因,克隆或合成目的基因  

                      2. 載體構建:,PCR方法:以含目的基因的克隆質粒為模板,按基因序列設計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點),PCR循環獲得所需基因片段。②通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉錄形成 cDNA 第一鏈,以逆轉錄產物為模板進行PCR循環獲得產物.構建重組表達載體載體酶切:將表達質粒用限制性內切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切,酶切產物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。PCR產物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。獲得含重組表達質粒的表達菌種,將連接產物轉化大腸桿菌DH5α,根據重組載體的標志(抗Amp或藍白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質粒,雙酶切初步鑒定。測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應篩選更多克隆,重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態細胞5.氯霉素?;D移酶重組蛋白的誘導。②按1:50或1:100 的比例稀釋過夜菌,一般轉接1 mL過夜培養物于100 mL (含100 ug/mL氨芐青霉素)LB液體培養基中,37℃震蕩培養至OD600 = 0.6-0.8(最好0.6,大約需3 h)。取10 ul樣品用于SDS-PAGE分析。接種含有重組氯霉素?;D移酶蛋白的大腸桿菌BL21菌株于5 mLLB液體培養基中(含100 ug/mL氨芐青霉素),37℃震蕩培養過夜。

                      ②按1:50或1:100 的比例稀釋過夜菌,一般轉接1 mL過夜培養物于100 mL (含100 ug/mL氨芐青霉素)LB液體培養基中,37℃震蕩培養至OD600 = 0.6-0.8(最好0.6,大約需3 h)。取10 ul樣品用于SDS-PAGE分析。
                      ③對照組不加誘導劑,實驗組加入IPTG至終濃度0.5 mmol/l,37℃繼續培養1-3 h.
                      12 000 rpm離心10 min,棄上清,菌體沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。
                      6.氯霆素?;D移酶重組蛋白的分離、純化
                      NTA層析柱的準備:在層析柱中加入1 mLNTA 介質,并分別用8 mL去離子水,8 mL上樣緩沖液洗滌。
                      ②重組蛋白的變性裂解:在冰浴中凍融菌體沉淀,加入5 mL上樣緩沖液,用吸管抽吸重懸,超聲波破裂菌體,用振蕩器等輕柔的混勻樣品60 min,4C 12000 rpm離心 30 min,將上清吸至一個干凈的容器中,并棄沉淀。取10ul上清樣品用于SDS-PAGE分析。

                      3. 蛋白表達與純化③對照組不加誘導劑,實驗組加入IPTG至終濃度0.5 mmol/l,37℃繼續培養1-3 h.12 000 rpm離心10 min,棄上清,菌體沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。6.氯霆素?;D移酶重組蛋白的分離、純化NTA層析柱的準備:在層析柱中加入1 mLNTA 介質,并分別用8 mL去離子水,8 mL上樣緩沖液洗滌。

                      4. 蛋白的大量表達與純化②重組蛋白的變性裂解:在冰浴中凍融菌體沉淀,加入5 mL上樣緩沖液,用吸管抽吸重懸,超聲波破裂菌體,用振蕩器等輕柔的混勻樣品60 min,4C 12000 rpm離心 30 min,將上清吸至一個干凈的容器中,并棄沉淀。取10ul上清樣品用于SDS-PAGE分析。

                      蛋白制備

                      1.His、GST、MBP等標簽多種表達方式同時進行,確保獲得目的蛋白

                      2.保證蛋白為普通緩沖可溶

                      3.純化的蛋白經過ELISA,Western-blot,或者其它生物活性驗證

                      4.可提供詳細表達純化條件,實驗數據以及菌株





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